Introducción
El cáncer de pulmón es el segundo tipo de cáncer diagnosticado a nivel mundial, específicamente el de células no pequeñas (CPCNP) en Estados Unidos de Norteamérica, que representa el 81 % 1,2. Dentro de los muchos factores de riesgo del CPCNP, los oncogenes tales como KRAS (29 %), EGFR (19 %), ALK (3 %), entre otros, son los principales marcadores genéticos responsables de llevar a cabo esta neoplasia 3,4. El gen quinasa de linfoma anaplásico (ALK, por sus siglas en inglés) traduce a una proteína de transmembrana ALK con dominio tirosina quinasa que, al fusionarse con el gen EML4 5,6, conduce la fosforilación constitutiva de la proteína ALK y desencadena una cascada de señalizaciones tumorales dentro de la célula 7. La fosforilación constitutiva en las células del CPCNP está siendo eludida con el inhibidor de la tirosina proteína quinasa de ALK "crizotinib", y dirige el ambiente tumoral hacia la muerte celular; sin embargo, mutaciones puntuales en aminoácidos específicos tales como L1196M, G1202R, C1156Y, y otros más, han generado resistencia farmacológica. Por tanto, ha surgido la necesidad de la búsqueda de nuevas moléculas como ceritinib, alectinib, brigatinib y lorlatinib, que ya están aprobadas por la Asociación Norteamericana de Administración de Alimentos y Drogas (FDA, por sus siglas en inglés) como algoritmo de tratamientos para evadir la resistencia y conducir hacia la apoptosis a las células tumorales 8-10. Sin embargo, según lo descrito anteriormente, las mutaciones puntuales dentro la proteína ALK parecen interminables, por lo que siempre surgirá la necesidad de la búsqueda de más moléculas inhibidoras selectivas de ALK con cada mutación puntual.
Por otro lado, la proteína BCL2 es directamente responsable de activar la apoptosis, y actualmente ha sido descrita como diana terapéutica oncológica debido a su alta expresión en muchos tumores 11,12. Una de las moléculas dirigidas hacia BCL2 es el ABT-199, aprobada por la FDA para su uso clínico en leucemia linfática crónica 13, además de ello, se han evidenciado resultados motivadores en el tratamiento de tumores sólidos, como el sarcoma, y en la terapia combinada 14,15.
De acuerdo con este argumento, en este estudio se identificó a BCL2 como otra diana de ataque para conducir a la célula tumoral hacia la apoptosis y evitar que la proteína ALK obtenga las mutaciones puntuales. En ese sentido, proponemos estudiar el comportamiento de la proteína antiapoptótica BCL2 en modelos celulares de CPCNP frente a los tratamientos con inhibidores ALK (crizotinib y alectinib) y evaluar mediante estudios bioinformáticos la interacción entre el inhibidor de BCL2 y la proteína ALK, con la expectativa de exhibir una inhibición dual.
Materiales y métodos
Diseño y población de estudio
El diseño de este estudio fue descriptivo, in silico e in vitro. Nuestra población de estudio fueron tres modelos celulares de CPCNP: Ba/F3 EML4-ALKWT, Ba/F3 EML4-ALKL1196M y Ba/F3 EML4-ALKG1202R, los cuales fueron generados por mutagénesis dirigida in vitro16. Los modelos celulares fueron mantenidos en un medio de cultivo RPMI® suplementado con suero bobino fetal inactivado al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Para asegurarse de su crecimiento celular, estos fueron incubados bajo condiciones y parámetros de temperatura de 37 °C y 5 % CO₂.
Variables y mediciones
Para determinar la susceptibilidad farmacológica, se utilizó el ensayo de proliferación celular con el reactivo CellTiter-Blue®; en este se calculó la dosis media máxima inhibitoria (IC50), cuyos valores referenciales (IC50 < 350 nM = sensible y IC50 > 350 nM = resistente), según Huan et al., permitieron determinar la sensibilidad o resistencia a los fármacos en los modelos celulares. Para ello, se cultivaron 105 células/mL de cada modelo celular (Ba/F3 EML4-ALKWT, Ba/F3 EML4-ALKL1196M y Ba/F3 EML4-ALKG1202R) en placas de 96 pocillos, y fueron expuestos a los fármacos crizotinib y alectinib en ocho concentraciones seriadas de proporción (1:3), con una concentración máxima de 10 μM y una mínima de 0 μM. Después de 48 horas de tratamiento farmacológico, los modelos celulares fueron expuestos al reactivo CellTiter-Blue® al 10 %, incubados por tres horas y posteriormente monitoreados en un espectrofotómetro Multiskan Go (TermoScientific®) a una longitud de onda de 490 nm. Los datos recolectados permitieron calcular la dosis máxima media inhibitoria (IC50).
Por otro lado, se procedió a determinar la apoptosis celular mediante citometría de flujo utilizando el kit de detección de apoptosis con anexina V eBioscience™ (Thermo Fisher). Se cultivaron células Ba/F3 EML4-ALKWT, BA/F3 EML4-ALKL1196M y BA/F3 EML4-ALKG1202R en placas de seis pocillos y se añadieron fármacos en las concentraciones de 100 nM crizotinib y 50 nM de alectinib. Después de 48 h de tratamiento, se recolectaron 500 000 células, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C y se volvieron a suspender en 200 µl de tampón de unión (1x). Se agregaron anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo AttuneTM NxT (ThermoFisher).
A continuación, se procedió a medir la expresión de proteínas mediante la técnica de western blot, que consistió en obtener lisados celulares mantenidos en laemly bufer (1X), los cuales fueron depositados en pocillos de gel de poliacrilamida SDS y transferidos a la membrana de nitrocelulosa. Luego, esta membrana fue bloqueada con leche libre de grasa (10 %) durante una hora, e inmediatamente después se inició el tratamiento con el anticuerpo primario anti-BCL2 (mouse) (Ab692, dilución 1:500 abcam®) y anti-Actina (rabbit) (ab8227, dilución 1:1000 abcam®) para dejar incubando por toda una noche a -4 °C. Al siguiente día, la membrana se expuso al anticuerpo secundario anti-mouse (ab190463, dilución 1:5000 abcam®) y anti-rabbit (ab205718, dilución 1:5000 abcam®), respectivamente, durante una hora; finalmente, fue revelada y expuesta en el Chemidoc Imaging Instrument (Bio Rad®), donde se evidenciaron las bandas de expresión.
Como último paso, se realizaron las simulaciones de acoplamiento molecular, donde en una primera etapa se importaron los códigos PDB 2YFX, 2YHV y 4ANS por separado en el programa YASARA™ 17, como molde del sustrato, y los códigos PDB 3AOX y/o 6O0K como molde del ligando. A continuación, se superpusieron ambas estructuras y se procedió a eliminar todos los objetos, dejando solamente la estructura ALKL1196M como sustrato y alectinib o ABT-199 como ligando. Seguidamente, se eligió el experimento de minimización de energía, se procedió a unir los objetos sustrato-ligando y, por último, la energía de interacción calculada por el software fue medida en kcal/mol.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en el software GraphPad Prism, versión 10.0.3. Para asegurar la reducción del sesgo estadístico, los experimentos se realizaron por triplicado y se tomó como dato de análisis el promedio aritmético ± el error estándar. El cálculo del IC50 se realizó mediante una regresión no lineal paramétrica, ajustada a un intervalo de confianza del 95 %. Para la comparación por grupos múltiples de variables, se utilizó Anova y el test de Tukey, y se consideró estadísticamente significativo si p < 0,05 (* = 0,0332; ** = 0,0021; *** = 0,0002; **** ≤ 0,0001) y no significativo si p = 0,1234.
Consideraciones éticas
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética en Investigación de la Universidad de Piura (n.° PREMED0820219). No se requirió la intervención de seres humanos o muestras biológicas. Se desarrolló en los laboratorios de investigación Cultivo Celular, Inmunología y Biología Celular y Análisis de Proteína y Bioinformática de la Universidad de Piura.
Resultados
Sensibilidad heterogénea del modelo EML4-ALKL1196M frente a los tratamientos con inhibidores ALK: crizotinib y alectinib
Los modelos celulares EML4-ALKWT, EML4-ALKL1196M y EML4-ALKG1202R se expusieron a dosis-respuesta con los fármacos crizotinib y alectinib para evaluar su sensibilidad y resistencia (IC50 < 350 nM = sensible y IC50 > 350 nM = resistente, valores referenciales según Huan et al.) 18. El modelo EML4-ALKWT mostró sensibilidad a crizotinib (IC50: 46 nM) y alectinib (IC50: 5,07 nM), EML4-ALKG1202R mostró resistencia a crizotinib (IC50: 616 nM) y alectinib (IC50: 1,22 μM), mientras que EML4-ALKL1196M mostró resistencia a crizotinib (IC50: 789 nM) y sensibilidad a alectinib (IC50: 195 nM); este último mostró una sensibilidad heterogénea a los inhibidores de ALK (ver Figura 1a). Por otro lado, el ensayo de apoptosis expresado en porcentajes ratificó la sensibilidad del modelo EML4-ALKWT (crizotinib: 23 %, alectinib: 74 %), la resistencia del modelo EML4-ALKG1202R (crizotinib: 5 %, alectinib: 5 %) y la respuesta heterogénea del modelo EML4-ALKL1196M (crizotinib: 12 %, alectinib: 25 %) (Figura 1b y Figura 1c). Nuestros resultados sugieren a estos modelos celulares como óptimos para el estudio de CPCNP.
Figura 1 Susceptibilidad farmacológica y ensayo de apoptosis en los modelos celulares. 1a) Evaluación dosis-respuesta de los modelos celulares Ba/F3 EML4-ALK mutante (WT, L1196M, G1202R) a crizotinib y alectinib: WT muestra sensibilidad a crizotinib (IC50: 46 nM) y alectinib (IC50: 5,07 nM), L1196M muestra resistencia a crizotinib (IC50: 789 nM) y sensibilidad a alectinib (IC50: 195 nM) y G1202R muestra resistencia a crizotinib (IC50: 616 nM) y alectinib (IC50: 1220 nM). 1b) Ensayo de apoptosis donde se verifica la susceptibilidad farmacológica de los modelos celulares frente a los tratamientos con crizoonitib y alectinib. 1c) Gráfico de barras donde se representa el ratio de apotosis total.
Expresión relativa heterogénea de la proteína BCL2 en los modelos celulares EML4-ALK
Se procedió a medir la expresión de la proteína BCL2 en los modelos EML4-ALKWT, EML4-ALKL1196M y EML4-ALKG1202R en tres condiciones diferentes: control = 0 nM (sin tratamiento), crizotinib = 100 nM y alectinib = 50 nM. Los resultados evidenciaron la sobreexpresión de la proteína BCL2 normalizada en los modelos EML4-ALKWT (control: 1,91 ± 1,5; 100 nM crizotinib: 1,63 ± 0,23; 50 nM alectinib: 0,95 ± 0,27) y EML4-ALKG1202R (control: 0,995 ± 0,12; 100 nM crizotinib: 0,072 ± 0,6; 50 nM alectinib: 0,636 ± 0,446), mientras que el modelo EML4-ALKL1196M (control: -0,196 ± 0,305; 100 nM crizotinib: -0,301 ± 0,27; 50 nM alectinib: 0,11 ± 0,04) mostró una expresión relativamente cercana al valor basal (Figura 2c). La expresión de BCL2 dentro de cada grupo celular no mostró diferencia significativa entre las condiciones sometidas de tratamiento, y el grupo celular que destacó fue EML4-ALKL1196M, con una expresión relativa cercana a la basal (Figura 2a y Figura 2b).
Figura 2 Expresión de la proteína BCL2 en los modelos celulares. 2a) Mapa de calor que representa la cuantificación de la expresión de la proteína BCL2 (valores superiores a 1: sobreexpresión; valores menores a 1: inhibición de la expresión). 2b) Gráfico de barras que muestra la expresión de BCL2 normalizada con el valor de la actina. Los modelos WT y G1202R exhiben la sobreexpresión de BCL2, L1196M exhibe la expresión de BCL2 cercana a la basal.
Actividad selectiva del ligando ABT-199 por la proteína BCL2
Se realizó una búsqueda del mejor ligando selectivo de la proteína BCL2. En la plataforma Uniprot, se introdujo el nombre de la proteína con el filtro de búsqueda en humanos. La molécula que cumplió estos parámetros fue identificada con el código P10415 19. En el apartado de estructura se identificaron 28 estructuras PDB (difracción de rayos X: 22 estructuras; resonancia magnética nuclear: 6 estructuras) y una estructura predicha por la inteligencia artificial AlphaFold. El primer criterio de exclusión fue seleccionar aquellas estructuras que estén en interacción con un ligando y no porten alguna mutación en la proteína BCL2 (n = 11) (Figura 3a). El segundo criterio de exclusión fue evaluar el nivel de resolución (alta resolución = valor cercano a 1A), para lo cual se tomó como punto de corte a valores inferiores a 2A. Las moléculas resultantes fueron identificadas con los códigos PDB 6O0K 20, 5VAU y 4LXD con ligandos identificados como ABT-199 (venetoclax), beclin 1 y navitoclax, respectivamente; este último no fue tomado en cuenta por no ser únicamente selectivo a BCL2, y tampoco beclin 1, por presentar un rol en la autofagia. ABT-199, también conocido como venetoclax, fue la única molécula que cumplió estos criterios, por tanto, se sugirió considerarla como un ligando selectivo de la proteína BCL2.
Figura 3 Proteína BCL2 (PDB: 6O0K) y su ligando ABT-199. 3a) Lista de PDB públicos descargados de la plataforma RSCB-PDB (https://www.rcsb.org), ordenados según el nivel de resolución. 3b) En la izquierda, la estructura tridimensional del PDB 6O0K (BCL2 en azul-verde, interaccionando con el ligando ABT-199 en rojo), y en la derecha, la interacción bidimensional del ligando ABT-199 con aminoácidos específicos dentro del sitio catalítico de BCL2 (imagen generada en LigPlot).
Exhibición de mayor energía de interacción entre ABT-199 y ALK respecto a los inhibidores crizotinib y alectinib
Se identificó al modelo ALKL1196M con una expresión basal de BCL2, por lo cual se eligió a este modelo para evaluar su interacción con ABT-199. Para ello, se realizó la búsqueda de la proteína ALK bajo el mismo protocolo de búsqueda para BCL2. La molécula ALK con estos parámetros, identificada con el código Q9UM73 21, mostró una estructura predicha por AlphaFold y 77 estructuras PDB (microscopía electrónica: 1; resonancia magnética nuclear: 5; y por difracción de rayos X: 71). Se identificaron las estructuras con la mutación L1196M (n = 7 estructuras) y con el ligando crizotinib (n = 3), y se obtuvieron los siguientes códigos PDB con su energía de interacción molecular: 2YFX (31 1677 kcal/mol), 2YHV
(31 1674 kcal/mol) (22) y 4ANS (37 0791 kcal/mol). Por otro lado, se procedió a predecir los acoplamientos y medición de la energía de interacción de los PDB descritos al interactuar con alectinib (ligando de referencia alectinib del código PDB 3AOX 23), y con el ligando ABT-199 (ligando de referencia ABT-199 del código PDB 6O0K) (Figuras 4a y 4b). Nuestros resultados evidenciaron diferencias significativas entre la interacción de ALKL1196M con ABT-199 con una energía de interacción superior a la obtenida con crizotinib y alectinib, los cuales son inhibidores directos de ALK, por lo que estos hallazgos lo sugieren como potencial ligando dual dirigido hacia la proteína BCL2 y ALKL1196M (Figura 4c).
Figura 4 Energías de interacción evidencian a ABT-199 como candidato de unión al sitio activo de la proteína ALKL1196M. 4a) Ligandos crizotinib, alectinib y ABT-199 interactúan con aminoácidos específicos del sitio activo de la proteína ALKL1196M (imagen generada en LigPlot). 4b) Mapa de calor muestra las energías de interacción entre las estructuras de ALKL1196M con crizotinib, alectinib y ABT-199. 4c) Gráfico de barras muestra el promedio de las energías de interacción, donde destaca ABT-199 con energía de interacción superior a crizotinib y alectinib.
Discusión
Los tratamientos con los inhibidores de ALK (crizotinib y alectinib) en los modelos celulares EML4-ALKWT, EML4-ALKL1196M y EML4-ALKG1202R evidenciaron sensibilidad y resistencia según lo reportado por la literatura, lo cual señala que estos modelos son óptimos para caracterizar la expresión de la proteína BCL2 durante los tratamientos 16,24,25. Por otro lado, estudios han revelado que la alta expresión de BCL2 en pacientes con CPCNP predice resultados favorables y podría considerarse como un marcador de buen pronóstico. En el presente estudio, los resultados evidenciaron a los modelos celulares EML4-ALKWT y EML4-ALKG1202R con una alta expresión de BCL2, por lo cual, según lo descrito previamente, serían buenos candidatos para ser sensibles a un inhibidor de BCL2, mientras que podría sostenerse la hipótesis de que la inhibición en el modelo EML4-ALKL1196M con expresión basal de BCL2 podría ser más efectiva 26,27.
Actualmente, la sobreexpresión de BCL2 es considerada como una diana terapéutica oncológica mediante el uso de pequeñas moléculas inhibitorias mimetizadoras de la proteína en mención, dentro de las que destaca ABT-199, conocida también como venetoclax 13,28.
En nuestro estudio, la búsqueda de inhibidores dirigidos a la proteína BCL2 también apuntó a ABT-199 como la molécula que reúne todas las condiciones con características de ligando. Del mismo modo, según nuestros hallazgos bioinformáticos, las energías de interacción con ALKL1196M son superiores a las interacciones con crizotinib y alectinib, respectivamente 22, por lo que se le sugiere como un ligando con potencial inhibición dual tanto para la proteína BCL2 como para ALK. Estos resultados son motivadores debido a que no se ha descrito a ABT-199 como un ligando dual; en la literatura lo refieren como un ligando selectivo de BCL2 ya aprobado por la FDA 13, mientras que otros estudios sustentan que ABT-199 podría tener un rol protagónico en la terapia combinada 29,30. A partir de este estudio, queda por dilucidar la expresión de ALK y BCL2 durante el tratamiento con ABT-199.
En conclusión, en los modelos celulares EML4-ALKWT, EML4-ALKL1196M y EML4-ALKG1202R se evidenció susceptibilidad farmacológica a crizotinib y alectinib según lo descrito por la literatura. Esto también fue confirmado por los ensayos de apoptosis. Por otro lado, los modelos celulares WT y G1202R evidenciaron sobreexpresión de la proteína BCL2, mientras que L1196 exhibió una expresión cercana a la basal. Además, nuestros estudios bioinformáticos sugieren la potencial inhibición dual de ABT-199 dirigido a BCL2 y ALK por presentar energías de interacciones superiores a la calculada por ALK en interacción con crizotinib y alectinib. Finalmente, como recomendación sugerimos estudiar la expresión de BCL2 y ALK en los diferentes modelos celulares EML4-ALK mutante durante el tratamiento con ABT-199, con la finalidad de demostrar su potencial inhibición dual, el cual impactaría para su aplicabilidad clínica debido a que los tres fármacos (crizotinib, alectinib y ABT-199) ya están aprobados por la FDA.
